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        1區,IF=27|借力m6A甲基化修飾,探索腎細胞癌耐藥性機制研究
        日期:2022年05月30日    來源:
        舒尼替尼耐藥性可分為原發性和繼發性耐藥性。雖然過往研究表明了導致舒尼替尼耐藥性的幾個潛在因素,但其在腎細胞癌(RCC)中的確切機制尚不清楚。2022年5月10日,浙江大學的研究者們在Molecular Cancer雜志上發表了文章“N6-methyladenosine-modifed TRAF1 promotes sunitinib resistance by regulating apoptosis and angiogenesis in a METTL14-dependent manner in renal cell carcinoma”。本文發現在RCC中,TRAF1的過表達通過一種METTL14依賴性方式,調節凋亡和血管生成途徑,從而促進舒尼替尼耐藥性,而靶向TRAF1可能是舒尼替尼治療患者的一種新型藥物干預方式。本文當中涉及到的m6A MeRIP-seqRNA-seq比色法檢測整體RNA修飾水平m6A RNA修飾相關酶PCR芯片MeRIP-qPCRRIP-qPCR等,云序生物均可提供技術服務。

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        發表期刊:Molecular Cancer
        影響因子:27.401
        發表時間:2022年5月10日
        研究方法m6A MeRIP-seqRNA-seq比色法檢測整體RNA修飾水平m6A RNA飾相關酶PCR芯片MeRIP-qPCRRIP-qPCR雙熒光素酶實驗
        文章鏈接N6-methyladenosine-modified TRAF1 promotes sunitinib resistance by regulating apoptosis and angiogenesis in a METTL14-dependent manner in renal cell carcinoma


        技術路線


        技術路線.png


        研究內容

        01  建立耐舒尼替尼的RCC細胞系和細胞衍生的異種移植模型
        為了表征在體外和體內RCC中的RCC舒尼替尼耐藥性,研究者們通過長期暴露于增加濃度的舒尼替尼,建立了兩個RCC耐舒尼替尼的RCC細胞系(78R和OSR),并通過舒尼替尼口服治療建立了耐藥細胞源性異種移植物(CDX-R)模型(圖1.A)。與相應的親本細胞(78S和OSS)相比,78R和OSR細胞對舒尼替尼表現出較差的反應,如IC50增加,集落形成能力增加,舒尼替尼治療下細胞凋亡減少和血管生成增加(圖1.B-F)。為了建立細胞來源的異種移植模型,作者將786-O細胞植入裸鼠體內,并在體內三次傳代期間用舒尼替尼治療小鼠。為了驗證傳代3異種移植物(CDX-R)的耐藥性,作者將CDX-R和CDX-S腫瘤植入裸鼠體內。結果表明,CDX-R腫瘤對舒尼替尼治療的敏感性低于CDX-S腫瘤,如KI67,CD31和CD10水平升高所表明的那樣(圖1.G-J)。
        圖1. 舒尼替尼耐藥模型的建立和驗證
        圖1. 舒尼替尼耐藥模型的建立和驗證

        02  TRAF1 在耐舒尼替尼 RCC 中的表達水平升高
        使用樹對細胞和CDX樣品進行RNA-seq分析,以研究與RCC中舒尼替尼耐藥性相關的的關鍵基因(圖2.A)。共鑒定了196個不同表達的基因,基因本體(GO)富集分析表明,血管生成和凋亡途徑可能對舒尼替尼耐藥性有影響(圖2.B-C)。在舒尼替尼抗性細胞和CDX-R模型中,TRAF1的表達在RNA和蛋白質水平上均顯著上調(圖2.D-G)。通過對CDX樣品進行IHC染色也觀察到相同的結果(圖2.H-I)。與這些發現一致,在對舒尼替尼反應較差的臨床患者中,TRAF1陽性細胞的頻率更高,染色強度更強(圖2.J-K)。重要的是,TRAF1表達較高的患者表現出較差的總生存期(圖2.L)。以上這些數據表明,TRAF1對舒尼替尼耐藥性具有潛在重要性。

        圖2. 舒尼替尼耐藥RCC中TRAF1表達水平升高
        圖2. 舒尼替尼耐藥RCC中TRAF1表達水平升高

        03  TRAF1對于促進舒尼替尼耐藥性至關重要
         在TRAF1敲降的RCC舒尼替尼耐藥細胞系中,舒尼替尼耐藥性顯著降低,而在TRAF1過表達細胞中,耐藥性增加(圖3.A-B)。同時,在菌落形成(圖3.C-D)和EdU測定(圖3.E-F)中觀察到類似的結果,表明TRAF1在RCC的舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用。此外,流式細胞術分析進一步顯示,TRAF1敲降時,舒尼替尼耐藥細胞凋亡增加(圖3.G),而TRAF1過表達時,舒尼替尼敏感細胞凋亡減少(圖3.H)。
        圖3. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用
        圖3. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用

        此外,管形成測定的結果表明,TRAF1過表達顯著增強了血管生成(圖4.A-B),并且TRAF1表達的減少抑制了血管生成(圖4.C-D)。我們發現TRAF1的相對RNA表達水平與TCGA數據庫中幾個下游基因(mTOR,VEGFA,RELA和PARP)的表達水平之間存在正相關關系,表明TRAF1與這些基因之間存在潛在關聯(圖4.E)。然后使用Western Blot分析進一步研究參與舒尼替尼耐藥性的特定下游蛋白質,顯示TRAF1過表達顯著激活AKT/mTOR/HIF1a/VEGFA途徑(圖4.F-G)。上述結果表明,TRAF1對于維持舒尼替尼耐藥性至關重要,沉默TRAF1可通過抑制血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡來增加舒尼替尼的效率。

        圖4. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用
        圖4. TRAF1在舒尼替尼耐藥性中起關鍵作用

        04  TRAF1受m6A RNA甲基化調節
        先前的研究表明,m6A是RNA中最豐富的堿基修飾,可以調節各種癌癥中基因的表達。作者假設TRAF1的上調表達可能通過m6A修飾進行調節。首先,通過使用比色法檢測整體RNA修飾水平,作者發現與親本細胞系或CDX-S樣品相比,舒尼替尼耐藥細胞系和CDX-R樣品中的m6A水平相應顯著上調(圖5.A-C)。此外,MeRIP-qPCR測定顯示,與野生型細胞相比,在舒尼替尼耐藥細胞中,TRAF1 mRNA中的m6A水平上調(圖5.D-E)。為了進一步證實假設,作者測量了RCC細胞系中m6A RNA修飾相關酶,發現METTL14在舒尼替尼耐藥細胞系中顯著上調(圖5.F)。為了進一步表征METTL14的表達,作者隨后檢測了其在CDX模型和臨床患者樣本中的表達,結果表明舒尼替尼耐藥組織中METTL14表達顯著增加(圖 5.G-H)。此外,在RNA和蛋白質水平上,METTL14和TRAF1表達之間存在正相關關系(圖5.I-K)。我們之前的m6A測序數據顯示,在METTL14敲低細胞系中,TRAF1 mRNA轉錄本中的m6A水平隨著TRAF1的表達而降低(圖5J)。同時,m6A MeRIP-seq數據顯示,在METTL14敲降細胞系中,TRAF1 mRNA轉錄本中的m6A水平隨著TRAF1的表達而降低(圖5.J)。與此結果一致,MeRIP-qPCR測定證實,當METTL14沉默或過表達時,TRAF1中的m6A水平相應降低或增加(圖5.M-N)。綜上所述,METTL14介導TRAF1 mRNA的m6A甲基化,正向調節舒尼替尼耐藥RCC細胞中的TRAF1表達。
        圖5. TRAF1受m6A RNA甲基化調節
        圖5. TRAF1受m6A RNA甲基化調節

        05  METTL14依賴m6A-IGF2BP2調節TRAF1的mRNA穩定性
        越來越多的證據表明,mRNA轉錄本上的m6A峰可以影響mRNA的穩定性。作者發現,與78S細胞相比,78R細胞中TRAF1轉錄本的半衰期增加(圖6.A)。為了探討METTL14是否通過調節其mRNA穩定性來調節TRAF1表達,作者用轉錄抑制劑放線菌素D(Act D)處理細胞,以測量調節METTL14表達時TRAF1轉錄本的半衰期。結果顯示,METTL14的過表達導致TRAF1轉錄本的半衰期顯著增加(圖6.B),而METTL14的敲降導致TRAF1轉錄本的半衰期顯著降低(圖6.C)。為了進一步驗證METTL14對TRAF1的調控取決于其mRNA轉錄本的甲基化這一假設,作者構建了具有TRAF1的3'UTR序列和相應突變體(Mut-3'UTR)序列的熒光素酶報告質粒(圖6.D)。雙熒光素酶實驗結果表明,WT(但未發生突變)METTL14顯著增強了TRAF1 3'UTR報告基因的表達(圖6.E)。此外,野生型METTL14和突變的METTL14都不能影響mut-3'UTR的熒光素酶活性,這表明了RNA穩定性的m6A依賴性調節(圖6.E-F)。
         
        為了鑒定參與TRAF1調控的reader蛋白,作者設計了靶向已報道的可增強RNA穩定性的reader的小干擾RNA,結果顯示IGF2BP2顯著影響了TRAF1的表達(圖6.G)。此外,RIP-qPCR顯示IGF2BP2和TRAF1 mRNA之間的直接相互作用(圖6.H)。同時,IGF2BP2和TRAF1轉錄本之間的直接相互作用在舒尼替尼耐藥細胞系中更強(圖6.I),而在調節METTL14表達后,此相互作用顯著受到影響(圖6.J-K)。TRAF1 mRNA穩定性在抑制IGF2BP2的細胞中受損(圖 6.L)。總之,這些發現表明METTL14介導的m6A修飾以IGF2BP2依賴性方式增強TRAF1 mRNA穩定性。

        圖6. METTL14 調節 TRAF1 的 mRNA 穩定性
        圖6. METTL14 調節 TRAF1 的 mRNA 穩定性

        06  TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性
        基于上述結果,作者假設TRAF1是METTL14在舒尼替尼耐藥中的功能靶標。為了驗證這一假設,作者進行了一系列挽救(rescue)實驗。CCK-8(圖7.A-B),菌落形成(圖7.C-D)和管的形成(圖7.E-F)測定結果顯示,METTL14過表達的78R細胞對細胞凋亡和血管生成有顯著抑制作用,而TRAF1的敲降降低了METTL14過表達對細胞凋亡和血管生成的增強效應。此外,在METTL14敲降細胞中觀察到細胞凋亡和血管生成的顯著增強,而TRAF1的過表達恢復了METTL14敲降產生的的抗凋亡和血管生成效應。Western Blot分析進一步證實,TRAF1通過以METTL14依賴性方式,調節凋亡和血管生成途徑來促進舒尼替尼耐藥性(圖7.G-H)。
        圖7.TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性
        圖7.TRAF1依賴METTL14維持舒尼替尼耐藥性

        07  在體內靶向TRAF1抑制RCC中的舒尼替尼耐藥性
        為了進一步證明體外研究結果并探索其潛在的臨床價值,作者采用了體內舒尼替尼耐藥模型(圖8.A)。在耐舒尼替尼的CDX小鼠的皮下植入部位周圍局部注射sh-TRAF1的AAV可以顯著恢復RCC細胞對舒尼替尼治療的敏感性。相比之下,在CDX-S模型中,局部注射OE-TRAF1的AAV促進了舒尼替尼耐藥性(圖8.B-D)。與體外結果一致,IHC染色顯示Ki67,CD31和CD105在sh-TRAF1處理的小鼠中的表達降低,表明sh-TRAF1處理的小鼠的抗凋亡和血管生成能力降低(圖8.E)。此外,TRAF1高表達有助于在舒尼替尼耐藥細胞中激活下游抗凋亡和血管生成途徑(圖8.F)。在不久的將來,靶向TRAF1可能是舒尼替尼治療患者的一種新型藥物干預。
        圖8. 體內靶向TRAF1延緩舒尼替尼
        圖8. 體內靶向TRAF1延緩舒尼替尼


        小  結
        本文章利用RNA-seq發現TRAF1在舒尼替尼耐藥細胞、CDX-R模型和臨床患者中的表達顯著增加。而TRAF1水平升高對于通過激活抗凋亡和血管生成途徑維持舒尼替尼耐藥性至關重要。耐舒尼替尼RCC中TRAF1水平的增加是由于其mRNA穩定性的增加,m6A MeRIP-seqMeRIP-qPCR顯示這是由TRAF1中m6A修飾介導的。此外,作者證實了METTL14依賴m6A-IGF2BP2調節TRAF1的mRNA穩定性,進而調節凋亡和血管生成途徑來促進舒尼替尼耐藥性。該研究結果提供了舒尼替尼耐藥的新機制,并表明靶向TRAF1及其途徑可能是舒尼替尼治療患者的一種新型藥物干預。


        云序生物m6A修飾研究五大模塊
        01 m6A RNA修飾測序
        m6A RNA修飾測序(m6A-meRIP-seq)
        對m6A RNA甲基化,目前最流行的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
        • m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
        • m6A  LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
        • m6A  Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
        • m6A  mRNA測序
        • m6A  miRNA測序
        02 檢測整體m6A RNA修飾水平
        LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
        精準高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
        比色法檢測整體RNA修飾水平
        快速檢測m6A整體甲基化水平
        03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
        m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
        尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
        04 m6A RNA修飾靶基因驗證

        MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒

        云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
        05 機制互作研究

        5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒

        篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
        5.2 RNA pull down -MS/WB
        篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
        5.3 雙熒光素酶實驗
        驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
        5.4 ChIP-seq
        篩選或驗證目標蛋白與DNA互作,研究相應的分子調控機制。

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